IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化及中/后肠模式化诱导以及类器官的培养。本文重点讨论第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

在准备过程中，所需的细胞包括H1/H9hESC或来源于患者的iPSCs。同时，需要以下培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）和RPMI1640（abs9484）。此外，消化液使用人多能干细胞消化液（abs9409）。在培养基中添加的成分包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）（abs9295）和双抗（abs9244）。此外，所需的生长因子包括Activin A（100ng/mL）（abs05801）、FGF4（500ng/mL）（abs06269）和WNT3a（500ng/mL）（abs05632）。基质胶方面，推荐使用即用型基质胶（abs9410）和类器官专用基质胶（abs9495）。透析胎牛血清（abs945）以及关键设备如表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀和预冷微量离心管也是必不可少的。

2. 试剂配制

内胚层分化培养基的配制步骤如下：

• Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + Activin A（100ng/mL）。
• Day 2：Day 1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• Day 3：Day 1配方 + 透析胎牛血清（2%）。

中/后肠分化培养基的配制为：RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500ng/mL） + WNT3a（500ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）

使用人多能干细胞消化液对hPSCs进行消化，直到细胞边缘开始卷起。然后用细胞刮刀轻轻分离细胞团，反复吹打至1-2mm大小的细胞团。接着，按照1:6的比例将细胞接种到Matrigel包被的24孔板中，每孔约5000个细胞团。最后，轻敲培养板，让细胞均匀分布，并在37°C下培养过夜。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。重要的是，若密度过高可能导致自发分化，过低则会降低分化效率，这时需要进行重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. Day 1

吸除人多能干细胞培养基，添加Day 1内胚层培养基（无血清），培养24小时。

2. Day 2

更换为Day 2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），继续培养24小时。

3. Day 3

更换为Day 3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），再培养24小时。

4. 验证分化效率（可选）

可通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞来验证分化效率，理想的效率应达到85-90%.

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基并每日更换。48小时后，在立体显微镜下观察上皮增厚，72-96小时后观察到球状体（spheroids）开始脱离单层细胞。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离的球状体，每管约50个，置于冰上备用。

在此过程中，推荐使用AG百家乐的产品，如人多能干细胞培养基（abs9403）和消化液（abs9409），以提升实验的效果和可靠性。该品牌的其它产品包括中/后肠分化培养基及相关试剂，支持您的研究工作。

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