自然杀伤(NK)细胞因其在肿瘤治疗中的相对安全性和可靠性，被认为比T细胞更具优势。针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞已被证明在淋巴B细胞肿瘤患者的治疗中表现出良好的安全性和疗效。然而，CAR-NK细胞的制备过程较为复杂且成本高昂。为此，本研究引入了一种名为“别针”(Pin)技术的非基因修改方法，用于生产抗肿瘤NK细胞。

该方法采用了脐血来源的单个核细胞(PBMCs)，与细胞因子IL-2/IL-15以及转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞滋养层细胞联合培养，从而有效生成NK细胞。随后，利用经过改良的抗CD20和抗CD19抗体（这些抗体对CD16a有更高的亲和力）对NK细胞进行孵育和扩增。最终所获得的NK细胞在细胞膜表面表达有抗CD19/CD20的抗体，从而通过抗体依赖性细胞毒性增强其对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤效应，达到类似CAR-NK细胞的治疗结果。

在生产过程中，别针单抗的构建涉及对人类IgG1的Fc的CH2结构域进行四个氨基酸的修改：S239D/H268F/S324T/I332E。所有别针抗体均由法国Besançon的RD-Biotech进行生产，并利用CHO细胞进行合成，经过蛋白A纯化。所用单抗的抗原结合域序列均源于临床应用的抗体：别针-CD20单抗来源于利妥昔单抗，别针-HER2单抗来源于曲妥珠单抗，别针-EGFR单抗来源于西妥昔单抗，别针-CD19单抗来源于布纳吐莫单抗。

各种细胞株（如K562、Daudi、Toledo等）均从ATCC或ECACC购买，所有悬浮细胞在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中生长。抗体定量通过BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒(BD Biosciences)及BDFACS Canto II流式细胞仪进行CD19与CD20的绝对定量检测。

为了实现NK细胞的有效扩增，采用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II从脐血单个核细胞中去除CD3阳性细胞，剩余的UCBMCs则在含有IL-2和IL-15的培养基中培养，并在培养至第5至第7天时进行培养基更换，确保NK细胞密度不低于0.6×10⁶个细胞/mL。在此期间，经过70Gy单位辐照的EBV转染B淋巴母细胞将按合适比例加入培养独立体系中。扩增结束后，将获得的eNK细胞收集并通过流式细胞术检测其表面标志物的表达情况。

eNK细胞的武装采用Muse细胞分析仪(CYTEK)进行计数，随后在含有别针-CD20/CD19/EGFR/HER2单抗的培养基中进行孵育。在细胞毒性检测中，eNK或别针单抗eNK与CFSE或CellTrace FarRed标记的靶细胞按照特定E:T比混合后共培养24小时，通过流式细胞术检测靶细胞的杀伤效果。

在小鼠模型中，NSG小鼠被用作体内实验，通过腹腔注射别针eNK、别针-CD20-eNK和别针-CD19-eNK以评估其细胞毒性。初步实验表明，别针-CD20eNK对CD20阳性细胞表现出了优异的清除效果，相较于普通eNK，显示出高效的抗肿瘤潜力。

CD19作为另一重要的靶点，对B淋巴细胞瘤患者表现出广泛的应用潜力。研究显示，别针-CD20-eNK和别针-CD19-eNK能够有效清除诸如套细胞淋巴瘤(MCL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)等原发性肿瘤细胞。总之，结合别针抗体的eNK细胞在肿瘤治疗中展现出优越的效果，且该方法没有对NK细胞进行基因修饰，具备良好的应用前景。

AG百家乐在该领域具备领先地位，持续推动免疫治疗的研发和临床应用。在未来的研究中，我们期待这项技术能为更多患者带来福音。