本文旨在介绍荧光标记技术中试剂与耗材的预处理及标记流程。首先，为确保实验数据的可靠性，试剂与耗材需在适当的温度下进行预冷处理。所需的材料包括PBS、4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100（PBS配制）、正常山羊血清一抗及其对应的荧光二抗（例如抗小鼠Alexa Fluor 488、抗兔Cy3）、DAPI染液、抗淬灭封片液湿盒等。此外，实验需要在4℃冰箱、恒温培养箱（20-37℃）以及配备多通道滤光片的荧光显微镜中进行。

在清洗步骤中，将细胞爬片用PBS浸洗3次，每次3分钟，同时轻柔吸弃液体以避免细胞脱落。随后，用4%多聚甲醛固定细胞，室温下静置15分钟，之后再用PBS洗涤3次，每次3分钟。对于膜蛋白抗原，可以跳过透化步骤；而对于胞内或核抗原，则需使用0.5% Triton X-100进行室温透化20分钟，并随后进行PBS洗涤3次，每次3分钟。

在进行血清封闭时，先将PBS吸干，然后滴加与二抗同源的正常山羊血清，室温封闭30分钟。接着吸弃封闭液（勿洗），直接滴加稀释的一抗以覆盖爬片，放入湿盒中，于4℃避光孵育过夜。清洗阶段使用PBST（PBS+0.1% Tween-20），重复3次洗涤，每次3分钟，吸干液体后，再加入对应的荧光二抗（如抗小鼠Alexa Fluor 488），于湿盒中于20-37℃条件下避光孵育1小时，随后用PBST洗涤3次，每次3分钟。

双重标记时需注重抗体匹配，确保两对一抗/二抗为不同种属（如小鼠与兔），且荧光光谱无重叠（例如488nm与555nm）。二抗应与封闭血清同源（如山羊来源二抗需对应山羊血清封闭）。为验证实验结果，建议同步设置阴性对照（不加一抗）及单标对照以验证交叉反应。

进行第二次封闭时，吸干PBST，再次滴加正常山羊血清，室温封闭30分钟。接下来，滴加不同种属的第二一抗（如兔来源），在4℃避光孵育过夜，再次使用PBST洗涤3次，每次3分钟。然后滴加另一种荧光通道的二抗（如抗兔Cy3），避免光照条件下一小时孵育，最后用PBST洗涤3次，每次3分钟。

DAPI复染阶段，将DAPI染液滴加并避光孵育5分钟，然后使用PBST洗涤4次，每次5分钟。在封片过程中，需吸干液体，滴加含抗淬灭剂的封片液，覆盖盖玻片并轻压以排除气泡，同时需避光保存以待观察。使用荧光显微镜时，建议依次采集多通道信号（避免串色），优先采集长波长信号（例如Cy3→Alexa 488→DAPI）。

在整个实验过程中，从二抗孵育开始需全程避光，以确保实验结果的准确性。封片后的样本应在-20℃下长期避光保存。此外，选择知名品牌的产品，如AG百家乐，能有效提高实验的可靠性与稳定性。