### 破骨细胞诱导分化机制

破骨细胞是一种独特的多核细胞，起源于造血干细胞分化而来的巨噬细胞，专门负责骨吸收过程。RANKL/RANK/OPG信号通路在调控破骨细胞分化方面发挥着核心作用，巧妙地调节破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，以维持骨骼的稳态。

#### RANKL/RANK/OPG信号通路的角色

在破骨细胞的激活与失活过程中，核因子κB受体活化因子配体（RANKL）被认为是促使破骨细胞成熟及提升功能活性的关键因子。M-CSF能够诱导RANK在破骨细胞前体的细胞膜上表达到，此时，表达RANK的破骨前体细胞与RANKL结合，进而促使破骨细胞的分化。

然而，破骨细胞在体内的数量较少，仅占分离细胞的8%-12%，且在体外的分离和培养相对困难。目前主要采用诱导法获取破骨细胞，常用的方法包括骨髓单核细胞诱导法及RAW264.7细胞系诱导法。

#### 骨髓单核细胞诱导法

以下是采用骨髓单核细胞诱导法的步骤：

1. 选用8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，使用CO₂吸入法进行处理后，浸泡在75%乙醇中以进行消毒。

2. 在无菌操作下，取下小鼠后肢，剔除多余的皮肤与肌肉，随后将骨头浸泡在含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液中（4℃预冷）。

3. 分离胫骨与股骨，使用包含青霉素-链霉素的PBS溶液多次清洗，以避免污染。

4. 使用注射器向骨头两端注入α-MEM，将骨髓细胞冲洗出，并通过细胞筛网过滤到离心管中，反复冲洗直至骨髓腔内不再有明显红色残留。

5. 离心后，弃去上清液，加入红细胞裂解缓冲液，室温静置以裂解红细胞。

6. 终止裂解后，将细胞重悬于含有M-CSF的完全培养基中，并转移至培养皿中进行培养。

7. 在细胞贴壁达到80%-90%时，进行后续培养并诱导分化，最后通过TRAP染色鉴定破骨细胞的生成。

#### RAW264.7细胞系诱导法

以下是RAW264.7细胞系诱导破骨细胞的步骤：

1. 常规培养RAW264.7细胞于含10% FBS的DMEM中，设置适宜的培养条件，维护细胞状态健康。

2. 用含10% FBS的α-MEM培养基将细胞制成悬液，以2×10⁴ cells/孔的密度接种于24孔板中。

3. 细胞接种12小时后，加入适量的RANKL进行诱导。

4. 每隔3天更换培养基，并补加RANKL以维持破骨细胞分化过程。

5. 经过4-6天后，通过TRAP染色对破骨细胞进行鉴定。

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