AG百家乐细胞爬片免疫荧光实验操作步骤

来源:柯婉菲日期:2025-03-12

操作步骤如下：

AG百家乐细胞爬片免疫荧光实验操作步骤

一、细胞处理

1. 在培养板中使用PBS对已爬好的细胞玻片进行浸洗，重复3次，每次持续3分钟。

2. 将4%的多聚甲醛滴加到爬片上固定15分钟，然后再次用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟。

3. 用0.5% Triton X-100（使用PBS配置）在室温下通透20分钟（若细胞膜上表达抗原可跳过此步骤）。

4. 进行血清封闭：用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸干PBS后，滴加正常山羊血清（前提是二抗来源于山羊），在室温下封闭30分钟。

5. 吸干封闭液体，无需清洗，每片玻片上滴加足够量的稀释好的一抗，并放入湿盒，在4℃下孵育过夜。

6. 使用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟。随后吸干多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中20-37℃孵育1小时，再用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。注意：从添加荧光二抗开始，后续所有操作尽量在较暗环境中进行。

7. 吸干液体后，再次在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30分钟。

8. 吸干封闭液体，滴加稀释好的第二种一抗，并在4°C湿盒中避光孵育过夜。注意：如果第二种一抗的种属要求不同于第一种（如小鼠与兔子）。

9. 再次使用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸干重复液体后滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中20-37℃孵育1小时，随后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。

10. 加入DAPI，避光孵育5分钟以对标本进行染核，之后用PBST清洗4次，每次5分钟，去除多余DAPI。

11. 使用吸水纸吸干爬片上的液体，应用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。

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