细胞融合的技术有多种方法，包括物理法（如电融合和激光融合）、化学融合法和生物融合法（如灭活的仙台病毒）。在化学融合法中，聚乙二醇（PEG）融合法是一种常用且有效的选择。聚乙二醇在分子量为200至700时呈无色、无臭的粘稠状液体，而在分子量大于1000时则呈乳白色的蜡状固体，可溶于水、乙醇及许多有机溶剂，同时对热稳定，不会与大多数化学品发生反应。通常用于细胞融合的聚乙二醇选择分子量为4000，常用浓度为50%，pH值调节在80至82（通过10% NaHCO3进行调整）。选择分子量较小的PEG可能导致融合效果不佳，同时具有毒性，而过大的分子量则会增加操作难度。经过实验，50%的浓度和偏碱性pH值能够实现最佳融合效果。此外，一些研究采用30%至50%浓度的PEG与10%的二甲亚砜结合使用。不同批次的PEG，即便分子量相同，融合率也可能存在显著差异，因此在使用时需加以注意。每一批聚乙二醇在使用前都需进行细胞毒性测试，以确保其安全性，建议采购高纯度的PEG，优先选择适用于气相色谱的产品.

在细胞融合的操作过程中，通常采用转动法和离心法等多种融合手段。融合时，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例可为1:1至10:1，最常用的是3:1或5:1的比例。

试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞
(2) 1640培养液100ml
(3) 完全1640液100ml
(4) 25% FCS－1640液50ml
(5) HAT培养液100ml
(6) 50% PEG：取分子量4000的高纯度PEG（日本进口或Serva）10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热至40℃的1640液10ml等量混合，并用酚红检查pH，通常不需调节。如pH值改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶
(8) 40孔塑料培养盘

操作方法

(1) 准备脾细胞。
(2) 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 25% FCS－1640液。
(3) 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
(4) 移去上清液。
(5) 轻敲管底部，使沉淀流动，并将沉淀管放置于40℃水浴中，以达到融合温度。
(6) 加入预热至40℃的50% PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，同时轻轻摇晃沉淀管，肉眼观察颗粒的出现，滴加过程中需持续2分钟。
(7) 加入1ml 1640液，边加边摇动，持续1分钟。
(8) 重复第7步一次。
(9) 再次加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
(10) 重复第9步一次。
(11) 加入15ml 1640液。
(12) 在室温下，400g离心1分钟使细胞沉淀。
(13) 去上清，轻敲管底部，加入25ml含HAT的完全1640液。
(14) 将融合的细胞液滴加至前一天种植有饲养细胞的40孔塑料培养盘，每孔1滴（约0.05ml）。
(15) 轻轻摇匀后，将其放入5% CO2、饱和湿度的37℃温箱中培育。
(16) 在第3、6、9、10天更换为含HAT的完全1640培养液。注意吸取上清液时要轻柔，确保不影响固定于孔底的细胞，并根据需要加入适量饲养细胞。
(17) 在第12、15日加入含HAT的完全1640培养液。在每次换液前使用倒置显微镜检查，大约在10天左右可观察到杂交瘤细胞的生长。大部分杂交瘤细胞在10至20天内会出现，但也有些可能需要约一个月。出现杂交瘤细胞后，吸取上清液以检查抗体的存在。

对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖和传代。在传代过程中，根据情况可以取消HAT液及完全1640液，改用10% FCS－1640液。同时保存于液氮中并进行克隆化，每代均需检查抗体以防止抗体细胞的变异和丢失。

细胞融合关键

1. 技术误差常常导致融合失败。例如，供者淋巴细胞未能产生免疫应答将直接导致实验失败。
2. 融合实验中的最大失败原因是污染，提供一个无毒无菌的操作环境是成功融合的关键。

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