细胞冻存原理

当细胞温度降至0°C以下时，细胞会经历脱水过程，导致细胞内部可溶性物质浓度升高，并可能形成冰晶。冰晶的大小直接影响细胞的生存状态，大型冰晶容易对细胞膜和细胞器造成损伤与破裂，从而影响细胞复苏后的存活率及状态。因此，在进行细胞冻存时，我们常采取两个关键措施：一是加入低温保护剂，二是进行慢速冷冻操作。

细胞冻存的时机

细胞应在生长状态良好时进行冻存，此时细胞密度应达到80-90%，通常细胞数量在106-107/ml之间。对于活力较差的细胞，其冻存后的存活率往往较低，因此选择适当的冻存时机至关重要。

低温保护剂使用

常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO），它作为一种渗透保护剂，可以迅速渗透细胞，提升细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结进程。在细胞冻结前，DMSO能够促使细胞内水分排出细胞外，在胞外形成冰晶，从而减少胞内冰晶并降低对细胞的损害，这对于提高细胞的复苏率非常重要。[AG百家乐]提供高效的细胞冷冻解决方案，确保细胞在冻存过程中保持活力。

慢速冷冻过程

通过使用程序性降温设备，可以有效地缓慢冷冻细胞，从而避免大冰晶的形成。如果没有设备，也可以将细胞依次放置在4°C 1小时，-20°C 2小时，最后在-80°C过夜，这种方式也能有效适应大部分细胞的需要。

冻存液的配置

冻存液应提前配置并静置于室温，以防止临时配制时产生的热量损伤细胞。标准冻存液的比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如果细胞较为珍贵，则可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤

1. 使用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；
2. 消化细胞：加入适量胰酶，在37°C培养箱中消化（例如在10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，注意不同类型细胞的消化时间有所不同，直至80%-90%的细胞变圆）；
3. 消化完成后，加入胰酶2倍体积的完全培养基以终止消化，随后以800-1000rpm离心3-5分钟；
4. 准备冻存管并进行标记，包括日期、细胞类别、人名和代数；待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管分装1-1.5ml，然后转移到冻存管中；
5. 将冻存管放入程序降温设备中，-80°C保存过夜，随后转移至液氮中保存。

注意事项

1. 细胞加入冻存液后需立即放入-80°C保存，避免在常温下放置过久；
2. 建议冻存细胞在-80°C条件下储存不超过半年，在液氮中则不建议超过2年。[AG百家乐]致力于为生物医疗领域提供最佳的细胞冻存方案。